Efficient Bioproduction of 3-Hydroxypropionic Acid from Methanol by a Synthetic Yeast Cell Factory推特 男同

ACS Sustainable Chemistry & Engineering (IF: 9.224）

导读

基于可再生资源的微生物生物制造是一种孤独于石油化工资源的可握续出产样子。3-羟基丙酸（3-HP）不错团聚成聚3-HP或加入到共聚物中，如聚羟基烷烃（PHA）。这些材料是可生物降解和生物相容的，并具有优良的机械性能。3-HP 可用作食物添加剂和药物制造，如饮料、罐头、果脯、抗癌药物、调理消化谈疾病药物。3-HP的生物合成不错通过三种路线扫尾：甘油路线、丙二酰-CoA路线，或β-丙氨酸路线。在这些路线中，丙二酰-CoA路线由于其热力学可行性、前体的可用性和不需要赞成因子维生素B12而具有引诱力。该路线的关节酶，丙二酰-CoA收复酶（Mcr），领有两个活性域，其中C端（Mcr-C）催化丙二酰-CoA收复成丙二酸半醛（MSA），N端（Mcr-N）催化MSA进一步收复成3-HP。大肠杆菌和酿酒酵母，已应用于丙二酰-CoA路线出产3-HP。代谢工程和合成生物学的出现使促进细胞代谢的无为重组成为可能，引起细胞3-HP的性能显赫提升。关连词，在出产中遍及使用糖类看成底物，引起了东谈主们对食物供应与耕地之间的潜在竞争的担忧。碳中庸的目的促使咱们探索可再生的一碳（C1）原料进行化学出产的替代生物工艺。C1原料，如一氧化碳、二氧化碳、甲烷和甲醇，是一类低价和无为使用的底物，可减少温室气体排放。甲醇具有液体特点和高收复后劲，是一种有出息的发酵底物。

最近，通过工程化的甲醇路线，行使甲基养分细菌Methylorubrum extorquens来出产3-HP， 将3-HP产量从69 mg/L提升到了91 mg/L。此外，高效的遗传器具不错再行转换细胞代谢，使之向化学过量出产发展。尽管有这些上风，由于甲醇代谢的复杂性，行使甲醇的碳通量导向化学生物合成仍然具有挑战性。

本商议中，咱们通过优化丙二酰-CoA路线、加强前体和赞成因子的供应以及提升甲醇行使率等代谢工程战略，对P.pastoris（毕赤酵母）进行了纠正，使其大致从单一的甲醇中过量出产3-HP。非凡是，通过代谢纠正一个游离脂肪酸（FFA）裕如的菌株，使其在摇瓶中高产1.9 g/L的3-HP。进一步缩短甲醇异化作用，将3-HP产量提升到2.2 g/L，并在生物反映器中扫尾了48.2 g/L的高产。这是使用甲醇看成独一的碳源出产3-HP的最高产量，标明P.pastoris具有用于甲醇生物转动的弘大后劲。

商议本色

本商议领先优化3-HP合成酶基因MCR的抒发，三级片大全加强前体和NADPH的供应。接着，使用甲醇看成独一碳源进行出产3-HP的摇瓶批量发酵。进一步下调甲醇异化作用，在生物反映器中进行喂养批次培养，提升3-HP的产量，成立了一个高效的P.pastoris细胞工场，用于3-HP的过度出产，扫尾了以甲醇为独一碳源高效合成3-羟基丙酸（3-HP），发酵罐产量达48.2 g/L。该商议清爽了毕赤酵母在甲醇生物转动中的弘大后劲。

商谈论断

本商议蓄意了一种工业酵母P.pastoris，通过使用丙二酰-CoA滋生的路线，让甲醇看成独一的碳源有用地出产3-HP。同期优化来自Chloroflexus aurantiacus的丙二酰-CoA收复酶基因MCR的抒发，加强前体和NADPH的供应，使3-HP的产量达到1.5 g/L。为了幸免耗时的基因操作，通过代谢将过度出产FFA的菌株向3-HP生物合成转动，使3-HP在摇瓶中的产量达到1.9 g/L。接着进一步下调甲醇异化作用，3-HP的产量被提升到2.2 g/L。随后在生物反映器中批次培养，从最小的培养基中取得了48.2 g/L的3-HP，产量为0.23 g/g甲醇。值得扎眼的是，这是从C1原料中出产3-HP的最高产量，而况与从酵母中的糖中出产的3-HP相等。从甲醇中出产高水平的3-HP凸起了P. pastoris看成甲醇生物转动的后劲。此外，本商议提倡的战略可用于在P.pastoris中从甲醇出产其他乙酰-CoA滋生物。

改变点

（1）甲醇的液体特点和高收复后劲被以为是一种有出息的发酵底物推特 男同。

（2）进一步缩短甲醇异化作用，并在生物反映器中扫尾了高水平出产。

（3）成立了一个高效的P.pastoris细胞工场，用于3-HP的大王人出产。

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附图：

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图1. 优化MCR的抒发。左边代表MCR的抒发容貌（线表露染色体整合，圆圈表露外显体质粒抒发），右边是3-HP的滴度和细胞密度。

图2. 3-HP出产的中心代谢工程。(A) 3-HP生物合成的见异思迁收罗决策。(B) 过度抒发供应前体乙酰CoA和丙二酰CoA的基因。(C) 过度抒发供应NADPH的基因。(D) 过度抒发与甲醇代谢关连的基因以出产3-HP。所罕有据均以三个样本的平均值±SD表露。与对照组（XY45）比较，不同的3-HP水平的统计学道理用学生t磨练来评估（*，P < 0.05；**，P < 0.01）。

图3. 出产FFA的菌株在3-HP出产历程中的代谢转动。(A）FFA生物合成向3-HP出产的代谢转动暗意图。(B) 从野生型菌株和FFA过量出产的工程菌株中的3-HP滴度和细胞密度。

图4. 甲醇异化路线的下调。(A）甲醇同化路线和异化路线的暗意图。下调的基因以绿色标识。(B) 在菌株FXY03中通过动手子替换下调FLD1或FDH1后，3-HP的滴度和菌株的细胞密度。(C) 在菌株FXY04中通过动手子替换下调FLD1后，3-HP的滴度和菌株的细胞密度。所罕有据均为三个孤独样本的平均值±SD。与对照组（FXY04）比较，不同的3-HP水平的统计学道理用学生的t磨练来评估（*，P < 0.05；**，P < 0.01）。

图5. 最终工程菌株FXY17H批量发酵出产3-HP。在摇瓶（A）或1 L生物反映器（B）中进行批量发酵。FXY17H是一个原型菌株，在FXY17中补充了HIS4标识。清爽了3-HP滴度（蓝色）、滋长弧线（空腹灰圈）、甲醇浓度或甲醇销耗量（空腹灰方）的时辰历程。差错条代表一式三份样本的SD。

原文蚁合

https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.3c00410推特 男同